精确的细胞计数是所有实验中非常重要的一步。理想情况下，应该同时对总的有核细胞（TNC）和活细胞进行计数。研究人员通常使用台盼蓝（Trypan Blue，产品号 #07050）进行TNC和活细胞计数。然而，对于含有红细胞（RBCs）的样本，仅仅使用台盼蓝区分有核细胞和红细胞是非常困难的。因此，我们推荐使用含亚甲基蓝的3%乙酸来进行有核细胞计数，使用台盼蓝进行活细胞计数。一起来看看他们的操作方法和注意事项吧！

无需裂红的有核细胞计数

对于含有红细胞的样本（比如全血和骨髓），应使用含亚甲基蓝的3%乙酸（产品号 #07060）进行有核细胞计数。乙酸能裂解红细胞和白细胞的细胞膜，剩下的白细胞的细胞核可以被亚甲基蓝轻微标记，而成熟的红细胞没有细胞核，因此不会被亚甲基蓝标记，此过程也无需裂红。

具体操作步骤如下：

1. 充分混匀单细胞悬浮液，并使用PBS或无血清溶液适量稀释。为了保证浓度的精确性，至少要在稀释液中加入20µL细胞原液。

例如：准备10倍稀释液

• 在微型离心管或者96孔板中加入180µL含亚甲基蓝的3%乙酸；

• 细胞悬液混匀后，取20µL加入上一步180µL含亚甲基蓝的3%乙酸的管或孔中。

  注意：经过适量的稀释后，适当的细胞浓度应该在血细胞计数板的每个方格（大的方格）中获得50到100个细胞。我们推荐从10倍稀释开始，但是最适合的稀释浓度取决于起始样本中的细胞数量。具体稀释方案请参考文末。

2. 使用酒精清洁血细胞计数板，并擦拭干净。

3. 使用干净的盖玻片盖住血细胞计数板。使用毛细管或者移液枪将一小滴（约10µL）经染色的细胞稀释液滴加到血细胞计数板上的盖玻片边缘，小心不要移动盖玻片。

4. 将血细胞计数板置于双筒显微镜上，调节显微镜到10倍镜并聚焦。如图1所示，计算四个绿色方格中每个方格的细胞数（核被染色的细胞），只计算下边和左边压线的细胞，而右边和上边压线的细胞不予计算 （如图2所示），反之亦可。

注意： 我们建议每个绿色方格中的细胞数量在大约50-100个，样本浓度在此范围内，细胞计数最为准确。如果样本浓度不在此范围内，最好重新准备稀释样本。

5. 如图1所示，每个方格代表0.1mm3的体积，大约相当于10-4mL。因此，细胞浓度可以用以下公式得出：每毫升中有核细胞总数 = （四个方格内细胞的总数 /4）× 细胞稀释比例 × 104

活细胞的计数

对于细胞有受损的样本（例如冻存的样本），应使用台盼蓝（Trypan Blue，产品号 #07050）确定细胞的活率。在台盼蓝染色实验中，有完整细胞膜的活细胞不会被染色，而细胞膜不完整的死细胞将被染成蓝色。因为台盼蓝是一种细胞质染料，被乙酸裂解的细胞不能用于台盼蓝染色。

具体操作步骤如下：

1. 将细胞与台盼蓝1：1稀释。

以PBMCs为例，准备10倍稀释液

• 在微型离心管或者96孔板中加入80µL PBS或无血清溶液稀释。再加入20µL混匀的单细胞悬液。

• 细胞悬液混匀后，取20µL上一步混匀液加入20µL台盼蓝试剂 。

  注意：a. 若细胞数量较高，在添加台盼蓝之前，可使用平衡盐溶液比如D-PBS（包含Ca++和Mg++，产品号 #37350）稀释。具体稀释方案请参考文末。b. 实验开始前请确保所有试剂，包括细胞样本的温度恢复至室温。

2. 将混合液静置几分钟。有且仅有死细胞会被台盼蓝染成蓝色，活细胞不会被染色。

注意：若细胞在台盼蓝染料中孵育时间过长，有可能会产生毒理作用且活细胞计数不准确。因此，推荐混合液静置时间不超过5分钟。

3. 使用酒精清洁血细胞计数板，并擦拭干净。

4. 使用干净的盖玻片盖住血细胞计数板。使用毛细管或者移液管小心地将足量的台盼蓝/细胞稀释液滴加到血细胞计数板上的盖玻片边缘，不要过量或太少。

5. 计算四个外侧方格中每个1mm2方格的细胞数。活细胞（未染色）和死细胞（被染成蓝色）分别计数。只计算上边和左边压线的细胞，而右边和下边压线的细胞不予计算 （如图3所示），反之亦可。

6. 活细胞数量（Cells/mL）计算如下：每毫升中活细胞总数 = 每个方格内未被染色的细胞的平均数 × 细胞稀释比例 × 104

死细胞数量（Cells/mL）计算如下：每毫升中死细胞总数 = 每个方格内被染色的细胞的平均数 × 细胞稀释比例 × 104

7. 细胞活率（%）计算如下：活细胞数量/总的细胞数量[活细胞+死细胞]=细胞活率（%）

操作视频

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推荐稀释方案